H. COMBRISSON

Objectifs

L'éthique de l'utilisation des animaux en recherche biomédicale a considérablement évolué. L'animal est considéré comme un être sensible, ainsi qu'il est dit dans la loi sur la protection de la nature (10 juillet 1976). De plus, la réglementation française de l'expérimentation animale, application des réglementations européennes, rend obligatoire le recours à l'anesthésie : " Les expériences sur les animaux qui peuvent entraîner des souffrances doivent être pratiquées sous anesthésie générale ou locale ou après recours à des procédés analgésiques équivalents, sauf si la pratique de l'anesthésie ou de l'analgésie est considérée comme plus traumatisante pour les animaux que l'expérience elle-même. " Ainsi, tout expérimentateur a le devoir moral d'évaluer la douleur qui sera infligée à l'animal lors des manipulations et de choisir les moyens adaptés pour la prévenir.

La question de l'évaluation de la douleur se trouve ainsi posée. Lors d'intervention chirurgicale, il est commode, en première évaluation de comparer avec des situations analogues chez l'homme. Cette méthode ne pourrait être véritablement réaliste que si la douleur était ressentie de la même façon chez tout individu, homme ou animal. On sait que les mécanismes neurologiques de transmission des stimulus nociceptifs sont similaires chez l'homme et les autres mammifères. On sait également que les stimulus nécessaires pour déclencher ces mécanismes sont très proches. On est cependant incapables d'appréhender la perception de la douleur chez l'animal : on ne peut pas déterminer si un animal ressent un stimulus nocif de façon identique et avec la même intensité que l'homme. De plus, si on connaît des variations importantes de la sensibilité à la douleur chez l'homme entre les individus, il en est de même chez les animaux : variations avec les espèces, les souches, les individus.

Outre la prévention de la douleur, l'anesthésie des animaux de laboratoire constitue le moyen souvent le moins stressant d'obtenir la contention nécessaire à une manipulation nécessitant une immobilité de l'animal. On peut ainsi être conduit à recourir à des anesthésiques pour des interventions ne provoquant pas véritable douleur.

Evaluation de la profondeur de l'anesthésie

La difficulté de cette appréciation tient au fait que selon les protocoles anesthésiques et les espèces animales les critères diffèrent. Il est cependant très important d'évaluer au mieux la perte de conscience des animaux anesthésiés, d'une part pour des raisons éthiques, on sait que chez l'homme, la mémoire des procédures chirurgicales constitue une expérience négative ; d'autre part pour éviter que des réactions sympathiques liées à l'absence de perte de conscience pendant les procédures perturbent les paramètres physiologiques.

L'anesthésie a généralement pour objectif d'abolir les sensations douloureuses, il est donc particulièrement important d'évaluer cette sensibilité, pour cela teste le plus souvent la disparition de réflexes :

Réflexe de retrait de la patte : un membre est étendu et l'expérimentateur pince entre ses ongles ou à l'aide d'une pince la membrane interdigitée. Si l'animal retire sa patte (ou même crie), l'anesthésie n'est pas assez profonde pour des manœuvres chirurgicales.

Chez les rongeurs, ce test peut être remplacé par le pincement de la queue. On peut également pincer le bord de l'oreille chez le cobaye ou le lapin ; il répond alors à une sensation douloureuse en secouant la tête et, éventuellement, par des vocalisations.

Il faut cependant remarquer que les différentes zones de l'organisme ne sont pas insensibilisées de façon identique ; il peut arriver qu'un animal ne réponde pas au réflexe de retrait de la patte et pourtant réagisse par exemple lors de l'ouverture de la paroi abdominale.

Réflexes oculaires : réflexe cornéal et palpébral. Chez les carnivores, le porc, les ruminants, les primates, ils disparaissent au cours du stade III d'anesthésie si l'on a recours aux barbituriques, aux anesthésiques volatiles... Le réflexe palpébral est difficile à apprécier chez les rongeurs ; chez le lapin, il ne disparaît que lorsqu'une anesthésie très profonde est établie.

La position des globes oculaires, la dilatation des pupilles et les mouvements oculaires ne constituent pas de bons moyens d'évaluer la profondeur de l'anesthésie.

Les réflexes sont cependant en grande partie à relais médullaire ; par conséquent, l'évaluation de leur persistance ne constitue pas une méthode totalement adéquate d'évaluation de la perte de conscience et de l'analgésie. C'est pourquoi il a été proposé d'utiliser l'enregistrement de l'électroencéphalogramme (EEG) pour évaluer la perte de conscience. Chez des rats anesthésiés au pentobarbital, Haberham et coll. ont enregistré l'EEG à l'aide d'électrodes préalablement implantées pour évaluer la profondeur de l'anesthésie testée par le réflexe de retrait de la patte. Ils concluent d'une part que le retrait de la patte n'est pas de façon uniforme en relation avec les changements de l'EEG ; d'autre part, que l'absence de réflexe ne coïncide pas obligatoirement avec des tracés EEG de perte de conscience. Cette étude montre que le test de retrait de la patte chez le rat anesthésié au pentobarbital ne constitue pas une preuve absolue de sa perte de conscience. Néanmoins, l'enregistrement de l'EEG n'est pas une méthode simple à utiliser chez l'animal.

La question de l'opportunité de l'utilisation des myorelaxants (bloquant la transmission neuromusculaire par action sur le récepteur post-synaptique à l'acétylcholine) chez les animaux de laboratoire a fait l'objet d'un éditorial de Drummond dans la revue Anesthesiology. Le premier point est bien sûr le fait que le recours exclusif à des myorelaxants pour assurer une contention chirurgicale n'est pas éthiquement acceptable. Cependant, il existe des indications valables de leur utilisation ; il faut alors qu'elle s'accompagne une anesthésie adéquate. Par exemple, pour l'étude de myorelaxants ou pour des études de neurophysiologie pour lesquelles toute activité électromyographique pourrait constituer un obstacle, le recours à des myorelaxants est obligatoire. La question qui se pose alors est : comment être sûr que l'animal est réellement profondément anesthésié alors qu'il est paralysé, ce qui empêche toute tentative de mouvement ou toute réponse à la stimulation de réflexes.

Le recours à l'enregistrement de paramètres physiologiques comme la pression artérielle, ou l'EEG ne donne pas de renseignements totalement sûrs. Une autre possibilité est de faire en sorte que la concentration alvéolaire d'un anesthésique volatile reste au-dessus d'un seuil. Mais quels moyens a-t-on de fixer précisément ce seuil chez les animaux ? Enfin, une méthode est proposée : faire une expérience pilote préalable pour déterminer le protocole anesthésique en l'absence de myorelaxants. Drummond précise qu'en l'absence de certitude quant à la réalité de l'anesthésie chez l'animal, le doute doit profiter à l'animal et l'utilisation des myorelaxants doit être évitée.

Interférences anesthésie - expérimentation

Tout protocole anesthésique est susceptible de provoquer des effets secondaires multiples. Dans le cadre de l'utilisation expérimentale des anesthésiques, il convient de les prendre en compte afin d'éviter les interférences avec l'expérimentation.

Un premier type d'interférence est rencontré lorsque l'enregistrement des paramètres étudiés est effectué pendant l'anesthésie. Un exemple est donné par une étude publiée en 1999 par Hayton et coll. Ils ont comparé les effets de 4 types d'anesthésie sur les études de potentiels évoqués chez le rat par stimulation du membre antérieur et postérieur. Les anesthésiques testés étaient : kétamine-xylazine, médétomidine, isoflurane et fentanyl /fluanisone-midazolam. Ils concluent que ce dernier protocole se révèle avoir le moins d'influence sur les paramètres mesurés, tandis que l'isoflurane et la médétomidine ont les effets les plus marqués : augmentation de la latence et diminution de l'amplitude des réponses.

Un deuxième type d'interférence de l'anesthésie avec l'expérience peut se rencontrer même si les paramètres sont étudiés après l'anesthésie. Un exemple fréquent est donné par les effets d'induction enzymatique. Une étude de Commissaris et coll. a montré que la demi-vie du pentobarbital chez les rats traités de façon chronique (injection intra-péritonéale (IP) et distribution d'aliment contenant du pentobarbital pendant 6 jours consécutifs) est seulement 12% de celle mesurée chez des rats contrôles (150 min versus 18 min) après administration IP de 20 mg/kg de pentobarbital.

Une étude réalisée sur des microsomes hépatiques isolés de rats a montré que de nombreux anesthésiques (18 sont testés) inhibent le métabolisme, médié par le cytochrome P450, de l'aminopyrine (substrat synthétique) et de l'acide arachidonique (substrat endogène) (LaBella et Queen, 1993). Il existe une corrélation très significative entre les concentrations absolues nécessaires pour l'anesthésie (EC50) et l'inhibition du cytochrome P450 (Ki ou IC50). Les valeurs de Ki varient entre 0,26 et 1,48 fois la valeur de EC50 correspondante, sauf pour 2 composés halogénés (chloroforme et halothane) qui s'avèrent 2,5 fois moins puissants pour inhiber l'activité enzymatique que pour l'activité anesthésiante :

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Anesthésique	Ki / EC50
Chloroforme	2,41
Enflurane	1,30
Halothane	2,54
Pentobarbital	0,72
Thiopental	0,48

Tableau I : Puissance inhibitrice (Ki) de différents anesthésiques sur l'activité aminopyrine déméthylase de microsomes hépatiques de rats, rapportée à la concentration anesthésique efficace (EC50). (d'après LaBella et Queen, 1993)

Ces effets d'induction enzymatique peuvent interférer avec des études portant sur des métabolismes ; par ailleurs, ils sont tout à fait néfastes lorsque des anesthésies doivent être répétées chez les mêmes individus.

Anesthésie par espèces

Cet article n'a pas la prétention de donner de façon exhaustive les protocoles anesthésiques utilisés chez les animaux de laboratoire. Notre objectif se restreindra aux protocoles les plus fréquents, chez les espèces les plus utilisées. Nous avons également exclu les carnivores pour lesquels les techniques d'anesthésie en expérimentation sont généralement identiques à celles qui sont utilisées en clinique. Le lecteur pourra se référer à deux ouvrages de référence : Flecknell (1996) et Kohn et coll. (1997).

Anesthésie des rongeurs

Les rongeurs sont, de loin, les animaux les plus utilisés en expérimentation (> 80 %) ; néanmoins, leur petit format rend plus difficile l'administration de produits par voie intraveineuse (IV) par exemple. De ce fait, pendant très longtemps, les méthodes les plus courantes ont été soit l'anesthésie à l'éther dans des cloches de verre, soit l'anesthésie par le pentobarbital en IP. Des protocoles anesthésiques plus nombreux et plus raffinés se sont par la suite développés.

Anesthésiques volatiles

• Ether : très longtemps largement utilisé, l'éther est pratiquement abandonné du fait d'une part de son caractère inflammable, donc dangereux et d'autre part de la qualité médiocre de l'anesthésie qu'il procure, s'accompagnant d'effets irritants sur l'appareil respiratoire.

• CO2 : l'utilisation de CO2 en proportion 50/50 avec de l'oxygène peut induire une anesthésie de courte durée indiquée par exemple pour le prélèvement de sang au sinus rétro-orbitaire.

• Méthoxyflurane : peut être utilisé en remplacement de l'éther dans des dispositifs peu coûteux (cloche de verre ou vaporisateurs).

• Halothane : l'anesthésie chez les rongeurs est réalisée en utilisant une chambre d'induction puis un appareil à anesthésie délivrant le mélange adéquat par un masque. L'halothane a un effet d'activation enzymatique mais seulement si l'application est de plus de 30 à 60 min ;de plus il a une action hépatotoxique. L'halothane est un bon anesthésique chez le cobaye, animal réputé difficile à anesthésier.

• Isoflurane : est l'anesthésique volatile le plus récent utilisé en médecine vétérinaire. Il présente une plus grande sécurité d'emploi que l'halothane.

Anesthésiques injectables

• Barbituriques : le plus utilisé est le pentobarbital, généralement administré par voie IP La dose recommandée est de 30 à 60 mg/kg par cette voie ; elle est de 30 à 40 mg/kg par voie IV. Chez les souris, la dose recommandée pour l'anesthésie par voie IP est de 40 à 70 mg/kg. Il existe une grande variation de la sensibilité à cet anesthésique en fonction des souches de souris.

L'analgésie provoquée par le pentobarbital chez les rongeurs est insuffisante pour les interventions chirurgicales lourdes ; il convient dans ce cas de prévoir en complément un protocole d'analgésie.

• Kétamine : l'utilisation de la kétamine seule produit chez les rongeurs une rigidité musculaire et une anesthésie insuffisante pour une intervention chirurgicale. En revanche, la kétamine peut être associée de façon intéressante à l'acépromazine, au diazépam, à la xylazine ou à la médétomidine.

L'association kétamine&endash;xylazine peut, par exemple, être administrée chez le rat par voie IM ou IP ; Elle provoque une bonne sédation avec une induction rapide d'une durée de 90 à 120 min. Cette association peut également être utilisée chez la souris. On peut associer kétamine et médétomidine. Une étude de Cruz et coll. évalue, chez la souris, cette association (kétamine 40 mg/kg et médétomidine 1mg/kg par voie IP). Elle provoque une bonne sédation, réalisant ainsi une très bonne contention chimique avec une induction rapide. Un avantage de cette association est la possibilité d'antagoniser les effets par administration d'atipamézole ; les animaux se réveillent rapidement et les effets secondaires sont ainsi limités.

La tilétamine associée au zolazépam peut être utilisée chez les rongeurs. La dose chez les rats est de 20 à 40 mg/kg IP, l'analgésie est variable ; de plus, les réflexes habituellement testés ne disparaissant pas, il est difficile d'évaluer la profondeur de l'anesthésie. Chez la souris, la dose de 80 mg/kg donne une sédation mais une mauvaise analgésie.

Chez le cobaye, Radde et coll. ont effectué une étude comparative de l'anesthésie produite par tiletamine-zolazépam, pentobarbital, méthoxyflurane, kétamine-xylazine, et kétamine-xylazine plus méthoxyflurane. Ils concluent que l'association kétamine-xylazine donne analgésie et sédation suffisantes pour des procédures moyennement douloureuses ; l'addition de méthoxyflurane potentialise à la fois l'anesthésie et l'analgésie.

• Propofol : induit rapidement une anesthésie de bonne qualité qui peut être prolongée par une perfusion à débit constant. L'inconvénient de cet anesthésique est la nécessité d'une induction par voie IV qui est stressante chez le rat. Brammer et coll. proposent de pallier cet inconvénient par une administration préalable de fentanyl-fluanisone par voie IP (0,5 à 1 ml/kg). Une injection en bolus de 0,1 ml de propofol permet alors d'induire une anesthésie qui pourra être maintenue par une perfusion (4 à 6 ml/kg/h).

• a-Chloralose et uréthane : ces anesthésiques peuvent être utilisés seuls ou associés. Ils présentent l'intérêt de perturber relativement peu les paramètres physiologiques cardio-vasculaires et respiratoires ; en revanche, ils sont tous deux très toxiques et doivent être réservés à des anesthésies sans réveil. Chez le rat, l'a-chloralose à forte dose provoque des convulsions. De plus, il a un pouvoir analgésique faible ; il ne doit donc pas être utilisé pour des procédures chirurgicales. L'uréthane peut être utilisé chez les rats à la dose de 0,5 à 1,5 g/kg IP ; il provoque une anesthésie profonde avec une très bonne myorelaxation, le temps de sommeil pouvant aller jusqu'à 24 heures. L'association a-chloralose-uréthane (250 à 400 mg/kg uréthane + 35 à 40 mg/kg a-chloralose) donne une bonne anesthésie pour une durée d'environ 6 heures.

L'uréthane est un produit à fort pouvoir carcinogène et mutagène chez les rongeurs ; de ce fait, son utilisation doit s'accompagner de mesures sévères de protection des expérimentateurs.

Une étude de Shimokawa et coll. est effectuée chez des rats implantés pour l'enregistrement chronique de la pression artérielle, de l'ECG et de l'activité nerveuse sympathique rénale. Ils comparent l'activité sympathique chez des rats anesthésiés par rapport à celle d'animaux vigiles. Les anesthésiques testés étaient : pentobarbital, a-chloralose, uréthane. Ils concluent que ces produits affectent de façon très différente le fonctionnement du système sympathique. Ils proposent comme meilleur choix l'association a-chloralose-uréthane.

• Anesthésie des lapins

Les lapins sont très souvent considérés comme les animaux les plus difficiles à anesthésier. Des explications peuvent venir de grandes variations individuelles des réponses aux anesthésiques, de leur sensibilité aux dépresseurs respiratoires, de la difficulté à les intuber ...

Anesthésiques volatiles

• L'utilisation de l'halothane ou de l'isoflurane chez les lapins constitue de loin la meilleure anesthésie pour les actes chirurgicaux lourds. Il faut cependant au préalable induire l'anesthésie et, de préférence, intuber les animaux. Flecknell et coll. ont étudié les effets de l'induction de l'anesthésie par l'halothane ou l'isoflurane soit au masque soit dans une enceinte d'anesthésie. Ils concluent que tous les animaux présentent des phases d'apnée (30-120 s) associée à une bradycardie marquée, ce qui augmente le risque de mortalité liée à l'anesthésie. Tous les animaux tentent d'éviter de respirer le gaz, ce qui suggère qu'il constitue un stimulus aversif.

Anesthésiques injectables

• Pentobarbital : il peut être utilisé par voie IV chez le lapin (25 à 60 mg/kg). Outre les inconvénients déjà cités pour les rongeurs, la dose nécessaire pour obtenir l'anesthésie chez le lapin est proche de la dose provoquant l'apnée. Il convient donc d'une part de trouver le bon rythme d'administration (1/3 de la dose puis injecter lentement par exemple) et, le cas échéant, de pratiquer des manœuvres de stimulation de la ventilation.

• Kétamine : elle ne donne pas seule une myorelaxation ni une analgésie suffisante ; elle est donc généralement utilisée en association, le plus souvent avec la xylazine (22 à 50 mg/kg kétamine, 2,5 à 10 mg/kg xylazine). Cette association permet l'intubation et peut s'avérer suffisante pour des procédures chirurgicales mineures. La kétamine peut également être associée à la médétomidine.

• Propofol : Aeschbacher et Webb en 1993 étudient l'induction de l'anesthésie par le propofol, le signe caractérisant la perte de conscience choisi étant l'absence de mâchonnement lors de l'introduction dans la bouche d'une sonde endotrachéale. L'induction était obtenue avec une dose (ED95) de 8,45 mg/kg avec un débit d'injection de 20 mg/kg/min. Ils préconisent d'utiliser une dose d'induction de 5 à 14 mg/kg avec une grande sécurité, les dépressions respiratoires ne survenant que pour des doses très supérieures. En l'absence de nouvelle administration, le réveil est rapide et calme.

Hellebrekers et coll. proposent d'associer le propofol (3mg/kg IV) à la médétomidine (0,35 mg/kg IM) ; ils observent une bonne qualité d'anesthésie permettant des procédures chirurgicales sans dépression respiratoire. Ils comparent ces résultats avec l'association médétomidine (0,35 mg/kg IM) et kétamine (5mg/kg) ; celle-ci donne une durée d'anesthésie plus longue et de qualité comparable, mais un apport d'oxygène est nécessaire pour éviter une hypoxie.

Ces quelques exemples de protocoles d'anesthésie ne sont pas des " recettes " ; il importe particulièrement dans le cadre de l'anesthésie en expérimentation de bien définir les objectifs à atteindre, les interférences à éviter en fonction de l'espèce, voir de la souche d'animaux utilisés. Un examen attentif de tous les éléments à prendre en compte du fait des procédures prévues et des animaux choisis est nécessaire pour garantir à la fois la réalité de la protection de l'animal et la qualité des études.

Bibliographie

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4. Cruz I.J., Loste J.M., Burzaco O.H. : Observations on the use of medetomidine/ketamine and its reversal with atipamezole for chemical restraint in the mouse. Lab. Anim., 1998, 32, 18-22

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10. Hellebrekers L.J., de Boer E.J.W., van Zuylen M.A., Vosmeer H. : A comparison between medetomidine-ketamine and medetomidine-propofol anaesthesia in rabbits. Lab. Anim., 1997, 31, 58-69

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